Spektrofotometrik kolorimetrik protein ölçümü
Proteinler genellikle proteinlerin bir karışımıdır. Kolorimetrik analizler protein bileşenlerine dayanır: Amino asitler (örneğin, tirozin, serin) renkli bir materyal üretmek için ek kromojenik grup veya boya ile reaksiyona girer. Renkli materyalin konsantrasyonu, proteinin reaksiyona girdiği amino asitlerin sayısı ile doğrudan ilişkilidir, dolayısıyla protein konsantrasyonunu yansıtır.
Kolorimetrik yöntem
BCA, Bradford ve Lowry gibi çeşitli yöntemler vardır.
Lowry metodu: En erken Biuret reaksiyonuna dayanarak geliştirildi. Protein, bir mavi reaksiyon üretmek için Cu2 ile reaksiyona girer. Bununla birlikte, Lowry metodu Biuret'ten daha hassastır. Dezavantaj, sıralı olarak birkaç farklı reaktif eklenmesi gereğidir; reaksiyon uzun zaman alır; Protein olmayan maddelere karşı hassastır; EDTA, Triton x-100 ve amonyak sülfat içeren proteinler bu yöntem için uygun değildir.
Bicinchoniinine acid assay: Bu daha yeni ve daha duyarlı bir protein analizidir. Analiz edilecek olan protein, bir alkalin solüsyonda Cu2 ile reaksiyona girerek, Cu, 562 nm'de emilim zirvesi olan bir mor bileşik oluşturmak üzere BCA ile bir şelat oluşturur. Bu bileşiğin ve proteinin konsantrasyonu arasındaki doğrusal ilişki güçlüdür ve reaksiyondan sonra oluşan bileşik çok kararlıdır. Lowry yöntemine göre, işlem basittir ve duyarlılık yüksektir. Bununla birlikte, Lowry yöntemine benzer şekilde, proteinler ve deterjanlar ile etkileşime yatkındır.
Bradford metodu: Bu yöntemin prensibi, proteinin Coomassie Brilliant Blue ile reaksiyona girerek 595 nm'de absorbe eden renkli bir bileşik üretmesidir. En büyük özelliği Lowry ve BCA'nın 2 katı olan hassasiyeti. Daha basit ve daha hızlıdır. Sadece bir çeşit reaksiyon reaktifi gerektirir. Bileşik sonucu kolaylaştırmak için 1 saat stabil olabilir; Lowry ile etkileşime giren BCA uyumlu indirgeyici maddeler (örneğin DTT, merkaptoetanol) ile reaksiyona girer. Bununla birlikte, hala deterjanlara karşı hassastır. Temel dezavantaj, farklı standartların, aynı numunenin sonuçlarında ve benzer sonuçlarda büyük farklılıklara yol açabilmesidir.
İlk kez kolorimetrik ölçümlere maruz kalan bazı araştırmacılar, çeşitli kolorimetrik testlerin sonuçları ile karıştırılabilir. Kafanızı karıştırmanın nasıl bir yöntemi var? Grupların farklı yollarla reaksiyona girmesi ve kromojenik grupların aynı olmaması nedeniyle, aynı numunenin numune konsantrasyonlarını tutarsız hale getirmek için aynı anda birkaç yöntem kullanılır. Örneğin Keller ve diğ. proteini insan sütünde test etti ve Lowry ve BCA ile ölçülen konsantrasyonların Bradford'a göre anlamlı derecede yüksek olduğunu buldu. Fark önemliydi. Aynı örnek belirlenmiş olsa bile, aynı kolorimetrik yöntemle seçilen standart numune tutarsızdır ve test sonrası konsantrasyon da tutarsızdır. Örneğin, proteini hücre homojenatında, standart olarak BSA, 1.34 mg / ml'lik bir konsantrasyon ve 2.64 mg / ml'lik bir konsantrasyonda bir globulin kullanarak test etmek için Lowry kullanın. Bu nedenle, bir kolorimetrik yöntem seçmeden önce, test edilecek numunenin kimyasal bileşimini belirtmek ve bir standart olarak kimyasal olarak benzer bir standart protein bulmak tercih edilir. Ek olarak, proteinlerin nicelleştirilmesi için kolorimetrik yöntem, numunenin absorbans değerinin çok düşük olmasıyla, genellikle, ölçülmüş numune konsantrasyonu ve gerçek konsantrasyon arasında büyük bir farkın ortaya çıkmasıyla problemlere neden olur. Temel sorun, 1011 spektrofotometrenin önemli kısmının renginin, küvetin belirli bir yarı ömrüne sahip olmasıdır, bu nedenle her bir kolorimetrik yöntem reaksiyon testi süresini listeler. Tüm örnekler (standart örnekler dahil) bu süre içerisinde test edilmelidir. Eğer zaman çok uzunsa, elde edilen absorbans değeri küçülür ve dönüştürülmüş konsantrasyon değeri azalır. Ek olarak, reaksiyon sıcaklığı, çözeltinin pH değeri, vb., Deneyi etkileyen tüm önemli faktörlerdir. Ayrıca, plastik kolorimetri kullanmak çok önemlidir. Kuvartz veya camdan yapılmış küvetleri kullanmaktan kaçının çünkü reaksiyondan sonra renk kuvars veya camın renklenmesini sağlayarak numunenin yanlış absorbansına neden olur.
Şirket, spektrofotometrelerin satışında uzmanlaşır, danışmaya ve satın almaya ihtiyaç duyan müşterilere hoş geldiniz, size samimi hizmet ve kaliteli ürünler sunmanın yanı sıra daha düşük fiyatlar sunacağız.
E-posta: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com