Spektrofotometrenin Genel Bileşenleri İlkesi ve Uygulamasına Giriş

Spektrofotometre biyolojik, kimyasal, klinik ve çevresel araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır.
Spektrofotometri, bir ışığın bir spektrofotometredeki bir numuneden geçerek bir kimyasalın ne kadar ışık emebileceğini ölçer.
Tespit edilen ışık yoğunluğunu ölçerek, yöntem numunedeki çözünen madde konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir.
Spektrofotometri kavramı
Numuneye gönderilen ışın, bir foton ışınından oluşur.
Fotonlar numunedeki molekülleri karşıladığında, moleküller bir kısmını emebilir, ışındaki foton sayısını azaltabilir ve tespit sinyalinin yoğunluğunu azaltabilir.
Geçirgenlik numuneden geçen ışığın bir parçasıdır. Olay ışık yoğunluğunda numuneden geçen ışık yoğunluğu olarak tanımlanır.
Absorbans, spektrofotometre tarafından ölçülen miktara karşılık gelen geçirgenliğin tersidir.
Absorbansa göre, çözelti numunesinin konsantrasyonu, absorbans ve numune konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki olduğunu gösteren Lambert yasa tasarısından belirlenebilir. Bira Lambert yasasına göre, absorbans, belirli bir dalga boyunda çözünen tarafından emilen ışık miktarının ve ışığın geçtiği mesafenin bir ölçüsü olan emilim katsayısının çarpımıdır. Numune veya hareket mesafesi ve çözünen konsantrasyon. Genel olarak, absorbansı ölçmenin amacı numunenin konsantrasyonunu ölçmektir.
Spektrofotometrenin bileşenleri
Her spektrofotometre bir ışık kaynağı, bir kolimatör (güçlü ve düz ışınları iletmek için bir odaklama cihazı), farklı dalga boylarındaki ışınları ayırmak için bir monokromatör ve istenen dalga boyunda dalga veya oluğu seçmek için bir uzunluk seçiciden oluşur. Bu videoda sunulan spektrofotometrede kullanılan ışığın dalga boyu, ultraviyole ve görünür ışık aralığındadır. Spektrofotometre ayrıca bir örnek tutucu, bir fotodetektör ve detektörün sonuçlarını gösteren bir ekran içerir.
En yeni spektrofotometre, deneysel parametrelerin kontrol edilebildiği ve sonuçların görüntülenebileceği bir bilgisayara doğrudan bağlanır.
Spektrofotometrenin çalışma prensibi
Spektrofotometri yaparken, kullandığınız biyolojik veya kimyasal çözeltinin türüne bağlı olarak eldiven giymek gibi uygun önlemlerin alınması önemlidir.
Örneğin UV-Vis spektrumunu ölçmeden önce cihazı açın ve lambanın ve elektronik aksamın ısınmasını bekleyin.
Analiz edilecek bileşenler olmadan aynı pH ve benzer iyonik kuvvete sahip aynı çözeltiden boş bir numune hazırlayın; küvet ve çözücü ışığı dağıtabileceğinden numuneyi analiz etmek gerekir.
Geleneksel spektrofotometre numune tutucusu plastik ve kuvars kapları tutacak şekilde tasarlanmıştır. Orijinal çözeltiyi bir kaseye pipetleyin.
Parmak izlerini sildikten ve kasenin dışına sıçrattıktan sonra, küveti doğru bir şekilde numune tutucuya yerleştirin ve kapak kapağını kapatın.
Kapıyı asla kapatmayı unutmayın, çünkü açık spektrofotometreden gelen UV radyasyonu gözlerinize ve cildinize zarar verebilir.
Numuneye iletilecek istenen dalga boyu veya dalga boyu aralığını programlayın. Bu, analiz edilen bileşenin emebileceği en iyi dalga boyuna bağlıdır. Daha sonra makine, numune tamponu nedeniyle alt absorbansı çıkaracak olan boş numune ölçülerek sıfırlanır.
Yaptığınız spektrofotometri deneyinin türüne bağlı olarak, numune ölçümünden önce, numunede analiz edilen bileşiğin konsantrasyonunun belirlenebileceği standart bir eğri oluşturmak gerekebilir.
Numunenin uygun sıcaklığa ulaşmasına izin verin ve kabarcıklar oluşmasını önlemek için hafifçe karıştırın. Numune daha sonra doğrudan makinenin içindeki kaseye eklenebilir ve bir okuma yapılabilir.
Numune absorbans için ölçüldükten sonra deney uygun şekilde hesaplanır; örneğin, konsantrasyon veya enzim aktivite seviyesini belirlemek için.
Spektrofotometre uygulaması
Spektrofotometrenin yaygın kullanımlarından biri hücre yoğunluğunu ölçmektir. Hücre yoğunluğu ölçümü, rekombinant proteinin entegrasyonu için en uygun zamanın belirlenebildiği bakterilerin logaritmik büyüme eğrisini üretmek için kullanılabilir.
Spektrofotometre ayrıca kimyasal reaksiyon hızını ölçmek için de kullanılabilir. Bu düzenekte absorbans, 452nm'lik bir ara reaksiyonla zamanla kaybolan enzimatik reaksiyonu izlemek için kullanılır. Bu enzimatik adımın oranı, veriler uygun denklemle eşleştirilerek hesaplanabilir.
Mikro spektrofotometrenin kullanılması, numune tutucu ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu spektrofotometreler numuneyi korumak için yüzey gerilimi kullanır.
Mikrospektrofotometre, proteinler ve nükleik asitler dahil biyomoleküller gibi küçük ve pahalı örneklerin kütlesini ve konsantrasyonunu ölçmek için en iyi seçimdir.
Proteinlerin 280 nm'de emilimi, triptofan, tirosin ve fenilalaninde bulunan aromatik yan zincirlerin içeriğine ve iki sistein arasındaki disülfür bağına bağlıdır.
Protein konsantrasyonu 280nm'deki absorbansı ve amino asitlerin bileşimine dayanan emme katsayısı ile belirlenebilir.
DNA ve RNA, konsantrasyonlarının belirlenebildiği 260 nm'de maksimum absorbansa sahiptir. Nükleik asitlerin saflığı, absorbans okumalarının spesifik dalga boylarına oranından da değerlendirilebilir.