Spektrofotometreler modern moleküler biyoloji laboratuvarlarında rutin araçlar haline gelmiştir. Genellikle nükleik asit, protein miktar tayini ve bakteri üreme konsantrasyonlarının miktar tayini için kullanılır.
Spektrofotometrenin basit prensibi
Spektrofotometre, birden fazla dalga boyu üretebilen bir ışık kaynağı kullanır ve belirli bir dalga boyuna sahip bir ışık kaynağı üretmek için bir dizi spektroskopik cihazdan geçer. Işık kaynağı test edilecek numuneden geçtikten sonra, ışık kaynağının bir kısmı emilir ve numunenin absorbansı hesaplanır, böylece bir numune konsantrasyonuna dönüştürülür. . Numunenin emiciliği, numunenin konsantrasyonuyla orantılıdır.
Nükleik asitlerin miktar tayini
Nükleik asitlerin miktar tayini, spektrofotometrenin en sık kullanılan işlevidir. Oligonükleotitler, tek iplikli, çift iplikli DNA ve RNA bir tamponda ölçülebilir. Nükleik asidin en yüksek absorpsiyon zirvesinin absorpsiyon zirvesi 260 nm'dir. Her bir nükleik asidin moleküler bileşimi farklıdır, bu yüzden dönüşüm faktörleri farklıdır. Farklı nükleik asit türlerini ölçmek için önceden karşılık gelen katsayıları seçin. Örneğin, 1 OD'nin absorbansı, 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA ve 30 μg / ml Olig'e karşılık gelir. Testten sonraki absorbans, karşılık gelen numune konsantrasyonunu elde etmek için yukarıdaki katsayılarla dönüştürülür. Test etmeden önce doğru prosedürü seçin, stok çözeltisinin ve seyrelticinin hacmini girin ve sonra boş ve numune çözeltisini test edin. Ancak, deney her zaman düzgün değildi. Dengesiz okumalar deneyci için en büyük baş ağrısı olabilir. Hassasiyeti daha yüksek olan aletler, absorbansta daha fazla kayma gösterir.
Aslında, spektrofotometrenin tasarım prensibi ve çalışma prensibi, absorbansın belirli bir aralıkta değişmesine izin verir, yani cihazın kesin bir kesinliği ve kesinliği vardır. Örneğin, Eppendorf Biyofotometrenin doğruluğu ≤% 1,0'dır (1A). Bu tür çoklu testlerin sonuçları, ortalamanın yaklaşık% 1.0'ı arasında değişir ve normaldir. Ek olarak, nükleik asidin fizikokimyasal özelliklerini ve nükleik asidin çözündüğü tamponun pH'sını, iyon konsantrasyonunu, vb. Göz önüne almak da gereklidir. Test sırasında iyon konsantrasyonu çok yüksek olduğunda, vardiyaların okunması, bu nedenle belirli bir pH değeri ve düşük iyon konsantrasyonu kullanılması önerilir. TE gibi tamponlar, okumaları büyük ölçüde dengeledi. Numunenin seyreltme konsantrasyonu da göz ardı edilemeyecek bir faktördür: numunede bazı ince parçacıkların, özellikle de nükleik asit numunelerinin kaçınılmaz olması nedeniyle. Bu küçük parçacıkların varlığı test sonuçlarına müdahale eder. Parçacıkların test sonuçları üzerindeki etkisini en aza indirmek için, nükleik asidin emiciliğinin en az 0.1 A'dan büyük olması gerekir ve emiciliğin tercihen 0.1 ile 1.5 A arasında olması gerekir. parçacıklar nispeten küçüktür ve sonuç kararlıdır.
Bu, numunenin konsantrasyonunun çok düşük veya çok yüksek olmaması gerektiği (fotometrenin test aralığının dışında) olması anlamına gelir. Son olarak, karıştırma gibi çalışma faktörleri yeterli olmalıdır, aksi takdirde absorbans değeri çok düşük, hatta negatif değerler; Karışım kabarcıklar içeremez, boş sıvının askıya alınmış bir maddesi yoktur, aksi takdirde okuma sert bir şekilde sürüklenir; Kör ve numuneyi test etmek için aynı küvet kullanılmalıdır. Aksi takdirde, konsantrasyondaki fark çok büyüktür; dönüşüm faktörü ve numune konsantrasyon birimi tutarlı bir şekilde seçilir; pencere aşınmalı küvet kullanılamaz; numunenin hacmi, küvetin gerektirdiği minimum hacme ulaşmalıdır.
Nükleik asit konsantrasyonuna ek olarak, spektrofotometre ayrıca, örneğin saflığını değerlendirmek için kullanılan A 260 / A 280 oranı gibi, örneğin saflığını değerlendirmek için kullanılan, örneğin proteinin emme zirvesi olduğu için, çok önemli bazı oranları da gösterir. 280 nm. Oranı 1.8 (DNA) veya 2.0 (RNA) 'dan büyük olan saf bir örnek. Oran 1.8 veya 2.0'dan düşükse, protein veya fenolik maddelerin varlığını gösterir. Bir 230 örnekte karbonhidratlar, peptidler, fenoller vb. Gibi bazı kirletici maddelerin bulunduğunu ve daha saf nükleik asit A 260 / A 230 oranının 2.0'dan büyük olduğunu gösterir. Bir 320, çözeltinin bulanıklığını ve diğer girişim faktörlerini tespit eder. Saf örnekler için, A 320 genellikle 0'dır.
Hangzhou Sümer Enstrüman Co, Ltd
Ekle: No.168 Wuchang Ave., Yuhang Bölgesi, Hangzhou 310023, Çin
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
E-posta: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com